Phos-tag SDS-PAGE データ集 histoneH1 ATPgammaS

histoneH1

ウシから精製したhistone H1(市販）の
PKAによる in vitro kinase assayです
リン酸基供与体として，ATPあるいは，ATP-γSを用いています。

ATP-γSは，ATPアナログとして，キナーゼアッセイに用いられます。
基質は，チオリン酸化体となります。
チオリン酸基を検出する優れた方法(WB)があり，非RIの観点からも汎用されます。

しかし，ATP-γSはATPの代替として，本当に同等であるかは検討されていませんでした。
MAPK kinase assayにおいて，MAPKによる両者の利用効率を比較しました。

Mn²⁺–, Zn²⁺– どちらのPhos-tag SDS-PAGEでも，
リン酸基と同様に，チオリン酸基も分離・検出可能です。
しかし，それぞれとの親和性に違いがあり，シフトアップの度合いは異なります。

ATP-γSを用いた場合，ATPとは異なり，
シフトアップするバンドが検出されず，リン酸化の効率が悪いと言えます。
用いた基質がどれだけリン酸化，あるいはチオリン酸化したかを
定量してその割合をグラフにすると次のようになります。

　　　　　　　 histone H1 graph

他のkinase assay でもATP-γSはATP よりも利用効率が悪いです。